关于 IVT 反应中 dsRNA 的形成机制，大体上可分为 3 种：

第一，Run off RNA 3'末端回折配对，启动自我延长；

第二，Run off RNA 与独立于 T7 启动子合成的反义链 RNA（-）互补配对；

第三，Run off RNA 与流产短片段（abortive transcripts）互补配对。

所以，我们要明确，IVT 反应中 dsRNA 是一系列大小各异的异质性 RNA 分子。目前，普遍认为，对于临床应用而言，mRNA 原液中的 dsRNA 含量应该保持在0.5%以下。要想减少 mRNA 原液中 dsRNA 含量，一方面可通过优化 IVT 反应来实现，例如，降低镁离子浓度（<10mM），掺入修饰核苷，使用突变 T7 RNA 聚合酶，优化富含 U 的序列以及 RNAse III 处理；另一方面就是在 IVT 反应结束后， 采用精纯工艺去除 dsRNA。然而，由于 dsRNA 与 ssRNA 的理化性质类似，给纯化带来极大的压力。常规纯化方法，例如，分子筛，亲和，超滤，很难有效去除 dsRNA。目前，科学家已证实两种可去除 dsRNA 的纯化工艺：阴离子交换色谱（AEX）和纤维素纯化。

西班牙 Certest Biotec 公司团队在 Frontiers in Molecular Biosciences 发表文章：Purification of linearized template plasmid DNA decreases double-stranded RNA formation during IVT reaction，这项研究首次证实线性化质粒模板的质量会影响 IVT 反应中 dsRNA 的生成。

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线性化质粒模板影响 IVT 反应中 dsRNA 含量

 

   

采用硅胶树脂纯化线性化质粒模板

所采用 Wizard® Megapreps DNA Purification Resin 纯化线性化质粒模板， Oligo-dT 亲和层析来纯化 IVT 反应液，Dot Blot 检测 dsRNA 含量。结果发现，对于 3 种不同的 mRNA 原液来说，Fluc mRNA 原液中 dsRNA 含量低于 1%，而 GFP mRNA 原液或者 COV-Spike mRNA 原液中检测到>1%的较高水平dsRNA。

这种现象引起了研究人员极大的兴趣，他们利用AEX-HPLC 检测 3 种线性化质粒模板，检测图谱显示，与 Fluc 线性化质粒模板相比，COV-Spike 和 GFP 线性化质粒模板纯度较低，而且，还存在一些不符合目标长度的小峰。因此，研究人员推测线性化质粒模板与 IVT 反应中 dsRNA 的生成有关系。

采用硅胶树脂纯化的 3 种线性化质粒模板合成的 mRNA 原液中 dsRNA 含量

AEX-HPLC 检测线性化质粒模板纯度

   

采用疏水层析纯化线性化质粒模板

AEX-HPLC 检测采用 BIA 疏水整体柱 CIMmultus C4 HLD 纯化得到的线性化质粒模板，与硅胶树脂纯化相比，主峰更加突出，杂质峰更低。与此相对应的是，oligo dT 亲和层析获得的 mRNA 原液中，以疏水层析制备的线性化质粒作为模板生成的 mRNA 原液中 dsRNA 含量发生显著下降。这组数据充分说明，使用高纯度的线性化质粒模板可明显减少 IVT 反应中 dsRNA 的形成。

采用疏水层析纯化 COV-Spike 线性化质粒模板

线性化质粒模板纯化方法不同造成 IVT 反应生成的 dsRNA 含量不同

   

在源头上减少 dsRNA 形成是最有效的方法

使用阴离子色谱纯化 IVT 反应液时，洗脱缓冲液 PH 为 11，因此，需要快速对收集组分进行中和，这种纯化方式非常容易造成 mRNA 降解。研究人员发现，如果采用 AEX 阴离子层析+oligo dT 亲和层析的顺序要比采用 oligo dT 亲和层析+AEX 阴离子层析纯化效果更好。

以硅胶树脂纯化得到的线性化质粒作为模板，IVT 反应结束后，如果只采用 oligo dT 亲和层析作为纯化手段，获得 mRNA 原液中 dsRNA 含量可达到 3%。如果采用 oligo dT 亲和层析作为粗纯，再以疏水层析作为精纯手段，获得 mRNA 原液中 dsRNA 含量依然可高达 2.3%。如果以 AEX 阴离子色谱做为初纯，再以 oligo dT 亲和层析作为精纯手段，获得 mRNA 原液中 dsRNA 含量依然可降至 1%附近。这说明 AEX 阴离子层析在去除 dsRNA 方面的效果上远好于疏水层析。

如果采用疏水层析作为线性化质粒模板纯化方法，则只使用 oligo dT 亲和层析纯化，便可使得 mRNA 原液中 dsRNA 含量小于 1%。

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小结

这项研究结果说明模板质量会影响 IVT 反应中 dsRNA 含量：模板质量纯度越高，IVT 反应中形成的 dsRNA 含量会显著下降。这种现象背后的详细机制还未清楚，可能是由于杂质 DNA 也会形成某些 RNA，与目标 mRNA 形成双链结构造成的。如果模板质量不佳，单纯靠后续精纯工艺，很难将 mRNA 原液中的 dsRNA 含量降至符合质量标准线以下。相比优化精纯工艺，将关注点放在提升模板质量上面，从源头上抑制 dsRNA 合成，IVT 后续纯化的压力将大为减轻。