强大而精确的色谱分析方法是高效开发mRNA生产过程的关键。本文mRNA分析平台是BIA Separations公司PATfix™分析及纯化工作平台家族的新成员PATfix™ mRNA分析平台，可实现mRNA工艺开发（PD）和生产过程中的在线监测，尤其是IVT反应成分（核苷酸和加帽试剂）以及最终产品的表征和定量，精准针对mRNA原液制备过程中的关键环节，为mRNA药物的生产提供关键支持，帮助其加速药物的开发。

三种方法

 下面分别介绍PATfix™ mRNA分析平台三种不同的分析方法，在PATfix™ mRNA分析平台中使用三种不同的色谱柱，支持mRNA工艺开发和最终产品的表征和定量。

方法1:使用CIMac PrimaS™进行

IVT反应监测

使用CIMac PrimaS™色谱柱（货号：110.5118-2）和PATfix™平台中的方法，可以实现对IVT反应成分的全面在线分析，该方法能够定量整个IVT反应中单个核苷酸、加帽试剂和mRNA的生成（图1）。该方法能够快速优化IVT反应，对mRNA的生产、规模扩大、技术转移或其他工艺开发活动至关重要。该方法对IVT主要成分的定量限（LOQ）是：核苷酸为6 ng，mRNA为12 ng。图1中所示的两个mRNA洗脱峰是两种不同的mRNA异构体。

图1.PrimaS色谱法分离关键的IVT成分PrimaS分析方法能够对单个核苷酸进行定量，包括以单个峰洗脱的CTP和UTP。估算UTP和CTP浓度的方法利用了这两种核苷酸在260 nm和280 nm处的紫外吸收面积之比的差异（图2）。

图2.CTP(1.04)和UTP(2.27)的 260/280 比值差异可用于定量PrimaS分析方法允许在线监测优化和非优化IVT条件下的反应动力学。图3和图4分别为通过CIMac PrimaS色谱柱分析的两组不同IVT反应条件下mRNA产生的示例。

图3.非优化IVT条件下IVT反应监测，终点mRNA浓度为1.5 mg/mL

图4.在优化的IVT条件下（终点mRNA浓度为7.9 mg/mL）的IVT反应监测

方法2:使用CIMac™ Oligo dT进行mRNA定量

使用CIMac™ Oligo dT（目录号：110.1219-2）和PATfix™平台中的方法，可以进行mRNA定量。CIMac™ Oligo dT是一种亲和柱，将Oligo dT连接到整体柱表面，与mRNA的聚腺苷酸尾（polyA）结合。当mRNA在洗脱步骤中洗脱时，所有没有polyA尾的其他物质（核苷酸、加帽试剂、DNA模板、酶）均在非结合条件下（流穿）洗脱。图5中mRNA的LOQ值为10 ng。

图5.使用Oligo dT色谱柱监测IVT样品的色谱图。未结合的物质如核苷酸、质粒、加帽试剂、酶和非聚腺苷酸化的mRNA在非结合条件下被洗脱。多腺苷酸化的mRNA在洗脱步骤中被洗脱。

使用CIMac™Oligo dT的分析方法，按照EMA和FDA的指南进行了验证，是一种精确和快速的方法，可以对纯的和复杂的样品中的多腺苷酸化mRNA进行定量分析，精确度达到或高于90%（图6）。

图6.方法精确显示，比较测量值与标称（通过Nanodrop获得）mRNA值。使用6条不同校准曲线的数据确定误差线。

方法3:使用CIMac™ SDVB进行

mRNA完整性表征和污染物检测

CIMac™ SDVB柱是一种反相柱，与离子配对试剂一起使用。在高温下使用乙jing梯度分析的方法可以按大小进行分离（图7），同时检测杂质，重点是dsRNA检测（图8）。SDVB分析法对RiboRuler高范围ssRNA进行大小分离

图7.CIMac SDVB色谱柱根据Thermo Scientific™ RNA High Range ladder的大小进行分离

SDVB分析法检测dsRNA杂质在最终的mRNA产物中，最关键的杂质之一是dsRNA。SDVB分析法可以单次色谱分离该杂质(图8)。dsRNA的分离用J2斑点免疫印迹实验证实。

图8.含有可检测含量的dsRNA的mRNA样品的色谱图

SDVB分析法是一种稳定的检测mRNA的方法

mRNA的完整性可以用CIMac™ SDVB柱来研究，主峰的前沿可能表示mRNA的降解片段或来自IVT反应的转录产物。

强制降解研究（1 M NaOH，10分钟）的mRNA药物物质（4000 nt）导致了可观察到的主峰前移，这是由于在主要的、完整的mRNA之前出现了一些片段。如图9所示，这些较短的片段是mRNA降解的结果。

图9使用强碱处理的mRNA强制降解研究实例

PATfix™ mRNA平台的应用

• 用CIMac PrimaS™色谱柱，在线定量监测IVT反应组分‍

• 用CIMac™ Oligo dT色谱柱，精确、快速地定量纯净和复杂样品中的多腺苷酸mRNA‍

• 采用 CIMac™ SDVB 色谱柱，可进行大小、完整性和 dsRNA 杂质检测

PATfix™ mRNA分析平台实时监测mRNA的生产以及工艺纯化的各个步骤，有助于对工艺流程作出及时的优化或更改，目前正在不断改进用于实现生物大分子的可重复分析分离的色谱方法，以满足随着不断扩大的需求增长的灵活性。

在BIA Separations的支持下，上海精瑞搭建了包含mRNA分析平台在内的PATfix™分析纯化工作平台，并且掌握了相关的分析纯化技术，可以提供前期方法的开发以及售后的技术支持。

如果您想了解更多关于PATfix™ 分析及纯化工作平台的信息，请随时与我们联系咨询。  

 关于我们 

 

BIA Separations

是Monolith整体柱层析的领xian制造者，使用高度互连的大通道网络进行对流传质，通道达到2-6 µm，是大分子mRNA等大小的10倍以上，从而同时实现超高流速和低剪切力，对纯化不稳定mRNA等大分子十分友好。Monolith层析柱采取预装柱的形式，无需繁琐装柱和验证步骤，使得层析过程在封闭系统中进行，大大降低了交叉污染与暴露于核酸酶而被降解的风险。该层析工艺快速灵活、可安全放大，有助于提高工艺的生产效率与经济效益。

 

上海精瑞科学

是BIA在中国区的战略合作伙伴，专注于生物医药，特别是基因/细胞治疗和疫苗（病毒疫苗及mRNA疫苗）领域的一站式设备和耗材供应。精瑞科学与行业优秀的产品制造商和生物制药公司关系密切，确保了尖端技术与最xin的专业技术协同。精瑞科学的产品涵盖了使用色谱方法进行从提纯物质的分析研究与开发，一直到纯化及放大生产。为帮助生物医药客户加快研究进展并扩大规模，精瑞科学为客户提供最完备的技术支持、本地销售、工艺开发及物流服务的一站式解决方案。