Exosome外泌体纯化新思路--BIA Separations

BIA本系列的三篇文章聚焦于外泌体分析纯化的挑战及解决方案，本篇是BIA这个系列的最后一篇文章。此前该系列的文章围绕外泌体纯化，提出了大规模工业生产纯化的挑战和解决方案以及纯化过程监测的分析方法。在此基础上，我们提出了一种完全可放大的纯化工艺，该工艺使用切向流过滤，结合耐盐核酸酶，之后将强阴离子交换整体介质作为抛光步骤。

以无血清细胞培养上清液为样本，该方法被开发用以富集不含宿主蛋白和 DNA 污染物的外泌体。该过程也可应用于其他源材料，如补充血清的细胞培养产物或包括血浆、血清或尿液在内的体液，但可能需要进一步的工艺开发才能产生最佳结果。

该方案被设计用于处理 50 mL 澄清细胞培养产物。这需要使用 1 mL 整体柱，这一规模可用于初始工艺开发。色谱方法的放大很简单，主要归结为在相同柱体积 (CV) 中沿用同一梯度持续时间，在 CV 中使用相同的流速（如果可能），应用相同的上样量（mg 样品/mL 柱体积），此外还要考虑柱外体积效应。
体柱

 

CIMmultus™ QA 1 mL Monolithic Column (2 μm channels) (Catalog number: 311.5113-2)

色谱柱

CIMmultus™ QA 1 mL 整体柱（2 μm 通道）（货号：311.5113-2）

缓冲液和溶剂

使用去离子水制备所有溶剂，并在使用前通过 0.2 µm 过滤器过滤。

对于整合了耐盐核酸酶处理的 TFF：

• 2L去离子水 (dH₂O)

• 1L 0.5 M NAOH

• 1L TFF/耐盐核酸酶缓冲液：50 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，pH 8.0

• 500 mL 流动相 A 缓冲液：50 mM Hepes，20 mM NaCl，pH 7.0

对于色谱：

• 1L 流动相 A 缓冲液：50 mM Hepes，20 mM NaCl，pH 7.0

注意：盐浓度可升高至能保留外泌体在柱上的最高值。较高的盐分有利于去除杂质。

• 500 mL 流动相 B 缓冲液：50 mM Hepes，2.0 M NaCl，pH 7.0

• 250 mL 柱清洗液：1.0 M NaOH 2.0 M NaCl

• 250 mL 柱再生溶液：1.0 M 醋酸铵

• 50 mL CIP 中和溶液：1.0 M 乙酸

• 1L 去离子水

• 50 mL 存储缓冲液：50 mM Hepes、100 mM NaCl、pH 7.0（不需要滴定）

样品制备

准备澄清的细胞培养产物。通过离心（建议 4,000 x G 离心 10 分钟）去除细胞和碎片，并通过 0.45 μm 注射过滤器过滤，对于更大体积，使用 0.45或0.65 μm 囊式过滤器。我们建议使用聚醚砜 (PES)过滤膜。

避免冻融步骤。为获得最佳结果，请使用新鲜细胞培养产物并遵循无冻融循环的步骤。冻结和解冻可能会导致上样时样品聚集和压力增加。

TFF 设置

除了 TFF，还可以使用系统蠕动泵。选择合适的 TFF 模块：TFF 模块孔隙率应尽量大，用以保留产物。可使用截留值介于 300 kDa 和 750 kDa 之间的 TFF 中空纤维过滤器（例如 mPES MidiKros^® 和 MicroKros^®，Repligen）或等效膜类产品。具有较小孔隙的膜将保留较大比例的污染物。选择合适的化学介质以防止产品与膜/纤维表面结合，例如 PES 或 mPES。作为 TFF 的替代品，可以使用具有 300 kDa 或 100 kDa 截留值或等效的 Vivaspin。

 

1. 将 TFF 模块连接到您的系统。

2. 用适量的指定用于 TFF 模块水合的 dH₂O 冲洗。确保每种溶剂/缓冲液被冲洗到渗透出口端。

3. 用 0.5 M NaOH（或 TFF 模块指定的清洁溶液）再循环 1 小时

4. 用 500 mL dH₂O 冲洗或直至 pH 为中性。

5. 用 250 mL TFF/耐盐核酸酶缓冲液（50 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，pH 8.0）冲洗或直至 pH 为 8.0。

结合耐盐核酸酶的 TFF

分别取TFF前的样品、第一次过滤的样品、耐盐核酸酶处理后的样品和第二次过滤的样品，以确定外泌体回收率和污染物去除情况。通过对渗透物取样检查 TFF 模块的完整性，并测试是否存在泄漏（产品现状）。

1. 检查您在第一步过滤时使用的缓冲液是否正确:：TFF/耐盐核酸酶缓冲液（50 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，pH 8.0）。
2. 准备用于耐盐核酸酶处理的样品：将过滤后的样品倒入 TFF 系统，并以恒定的滞留体积进行缓冲液交换，直到渗透体积为 6 倍透析体积 (DV)。推荐的跨膜压力 (TMP) 为 2–3 psi。不要超过 3 psi。推荐进料速度：40–100 mL/min。如果 TMP 增加，则降低进料速度。
3. 用耐盐核酸酶处理：停止流动并将 TMP 设置为零（关闭渗透阀或手动关闭渗透出口）。每 50 mL 澄清细胞培养物添加 1.25 U 耐盐核酸酶。根据制造商的说明（例如，使用 Saltonase、HL-Nuclease (EN32)、Blirt），添加活化剂 MgCl₂，浓度至少为 1 mM Mg2+。在室温下以低流量再循环 1-2 小时。
4. 将您的渗滤缓冲液更换为流动相 A 缓冲液（50 mM Hepes、20 mM NaCl、pH 7.0）。
5. 去除残留的耐盐核酸酶和水解产物：释放渗透液流并将 TMP 恢复到 2–3 psi。以恒定滞留体积更换缓冲液，用于另外 6 DV。现行方案建议进行 2 次渗滤，每次 6 个渗滤体积。根据您的产品经验减少或增加渗滤。
6. 收集保留物并用 10 mL 流动相 A 缓冲液冲洗 TFF 膜以获得更好的回收率。您的样品已准备好用于色谱分析。
7. 如有必要，将您的 TFF 保留物在 4°C 下保存过夜。如若需长期储存，请将保留物冷冻至 -80°C。
8. 清洁 TFF 模块：按照您的 TFF 模块推荐程序，如用 0.5 M NaOH 清洁 1 小时。确保清洗渗透出口。用 dH₂O 冲洗掉残留的 NaOH直到 pH 值接近中性。将模块存放在 20% 的乙醇中。

作为替代工艺，可以使用离心、聚乙二醇 (PEG) 沉淀和低 pH 沉淀。

在 CIMmultus QA 柱上运行阴离子交换层析

 使用支持 1–10 mL/min 流速、线性梯度的液相色谱系统，包括电导率监测器和流通池路径长度为 2–10 mm 的 UV 监测器。10 mm 的光程将提供更高的灵敏度。
 1. 确保您的系统和色谱柱是干净的（按照说明手册或寻求帮助）。
2. 将 LC 系统的最大压力限制设置为 1.8 MPa（柱前压力）。根据指导手册中的流向说明连接色谱柱。
3. 用 20 mL 无菌过滤去离子水冲洗柱子。
4. 根据指导手册用 10 mL 流动相 A、10 mL 流动相 B 和 10 mL 流动相 A 平衡色谱柱。
5. 继续使用 10 mL 流动相 A 来设置色谱运行的基线。
6. 在开始色谱运行之前，检查柱后的电导率和 pH 值，使其与流动相 A 的电导率和 pH 值相匹配。 使用电导率监测器和 254 nm (260 nm) 和 280 nm 的紫外吸光度监测色谱运行情况。
在开始之前，请检查样品是否已完全解冻并检查是否有沉淀迹象。如果样品包含可见的颗粒，请通过 0.45 PES 过滤器过滤。样品可能略微粘稠。如有必要，降低加载过程中的流速。
1. 与色谱柱结合：以 5-10 mL/min (5-10 CV/min) 的流速将 50 mL 起始原料中经 TFF 耐盐核酸酶处理的样品的全部体积上样到柱子上。观察上样过程中的压力曲线，如果压力呈指数上升，则中断上样。
2. 用至少 20 mL 流动相 A 清洗未结合的物质。
3. 将流速降低至 1 mL/min进行馏分收集。可选择在更高流量下运行。以非常高的浓度洗脱 EV 会导致压力增加。以低流速洗脱或使用压力控制工具（如果可用）（Akta 系统）并将压力释放阀设置为 0.5-1 MPa。
4. 设置梯度以在 20 个柱体积（20 分钟，流速 1 mL/min）中达到 100% 流动相 B。收集组分 - 外泌体将在此步骤中洗脱。要获得更高的 EV 浓度，请缩短梯度或逐步洗脱。为了提高分辨率，增加梯度长度。
5. 用 1 M NaOH 2 M NaCl 溶液洗脱粘在柱子上的物质并收集原位清洗 (CIP) 峰。出于分析目的，用 1.0 M 乙酸或等效物中和 CIP 峰部分。
6. 分析含有外泌体的组分。
7. 按照程序进行清洁和再生。
简而言之，用至少 10 CV 的柱清洗液（1 M NaOH、2 M NaCl）冲洗色谱柱。可以通过缓慢的清洗液再循环将其延长至 1 小时。用水（10 CV）冲洗掉清洗液，并用柱再生液中和 pH，直至柱出口处的 pH 值与再生溶液的 pH 值相匹配。收集含有外泌体的组分。对于长期储存，将组分缓冲液交换为选择的配方缓冲液，例如 50 mM Hepes 100 mM NaCl pH 7.0 或用流动相 A 稀释并储存在 -80 °C。请按照色谱柱随附的说明手册进行 CIMmultus QA 的清洁和再生，或者在需要帮助时联系我们。

无需酶预处理的简化工艺

该工艺旨在以尽可能小的剪切应力快速纯化EVs。省略了 TFF 和其他柱前衍生步骤，以缩短处理时间并降低向 EV 颗粒引入剪切应力的风险。尽管 TFF 发挥着重要作用，但它的好处可能是有代价的。据报道TFF 过程中产生的剪切应力会剥离脂质包膜病毒的外层包膜，并使非脂质包膜病毒的脆性衣壳破裂。

对于不包括 TFF 的流程，请使用“在 CIMmultus QA 上运行的阴离子交换色谱”中所述的相同流程步骤。请改用以下流动相：• 流动相 A：50 mM HEPES、50 mM NaCl、1 % 山梨醇、0.05 % 泊洛沙姆，pH 7.5注意：盐浓度可升高至能保留外泌体在柱上的最高值。较高的盐分有利于去除杂质。• 流动相 B：洗脱缓冲液：50 mM HEPES、2 M NaCl、1% 山梨醇、0.05% 泊洛沙姆，pH 7.5• 柱清洗溶液：1 M NaOH、2 M NaCl• 柱再生溶液：1.0 M 醋酸铵，pH ~7.0（无需滴定）。 除了离心和过滤之外，使用缓冲液 A 稀释样品以达到上样过程的柱结合条件。 此方法的示例色谱图可在图 5 中找到。

工艺开发和放大建议

该方案描述了为用不同培养基及补充成分的天然干细胞和 HEK 细胞培养产物推荐的起始程序。CIMmultusTM QA柱的结合能力取决于您的产品 (EVs) 浓度和样品中的污染物。可通过实验确定每个样品的浓度和污染物。应使用 TFF 和核酸酶或替代方法尽量减少与EV竞争性结合色谱柱的宿主细胞蛋白质和 DNA，以确保 CIMmultusTM QA 柱的最大容量。根据我们的经验，最多可将 1000 mL 预处理的含 EV 样品加载到 1 mL 柱中。请注意，最佳结合量在总容量的 60-80% 范围内，扩大规模时需考虑。CIMmultusTM QA 色谱柱提供GMP 和非 GMP 形式的全体积范围产品用于工艺开发和制造，欢迎与我们取得联系

色谱图展示了从HEK 293T 无血清细胞培养产物运行阴离子交换色谱的示例。在 254 nm 和 UV 280 nm 处监测吸光度。使用具有 750 kDa 截留值的 TFF 和耐盐核酸酶制备上样样品。根据在盐梯度中洗脱的峰收集组分。分析流穿 (FT)、组分 1–5 (Fr. 1–5) 和就地清洗 (CIP) 组分的外泌体相关表面抗原（图 3）。

HEK 293T 产物、TFF 滞留物和 AEX 层析运行的组分（图 1）用 SDS PAGE 分离，并用Western blots分析外泌体特异性抗原 CD-63。FT 和 CIP 部分中没有外泌体。外泌体富集于 Fr.1 和 Fr.2 组分。请注意 Fr.1 和 Fr.2 之间染色模式的差异，这意味着它们代表不同的外泌体群体。

源材料（图 4：左）是澄清 HEK 293T 细胞培养产物。产物用具有集成耐盐核酸酶的 TFF 处理（图 4：中间）。最后，来自 TFF 滞留物的外泌体在 AEX 整体柱上浓缩和分离。SEC 色谱图（图 4：右）代表组分 Fr.1。

 

 一直以来，BIA Separations是质粒DNA、AAV、mRNA高效率纯化的引领者。不仅提供整体柱及平台方法，还提供定制的纯化服务，以满足质粒DNA、AAV、mRNA规模化生产的纯化需求。