CIMac AAV Empty/Full 分析柱是AAV生产过程中快速分析，尤其是对AAV实衣壳和空衣壳进行定量的利器。尽管新的色谱化学和方法使我们有可能以更接近AUC（分析型超速离心技术）的方式来区分空衣壳和实衣壳（请继续关注更新！），但是目前现有的方法侧重于提高空衣壳和实衣壳两个同质群体之间的分辨率。

根据Wang等人的前期工作（报道季铵盐-QAS与NaCl相比能更好地实现空衣壳和实衣壳的分离），BIA实验室将四甲基氯化铵（TMAC）和氯化胆碱与NaCl一起进行测试。此外BIA实验室也测试了上述所有盐在添加MgCl₂后的色谱性能（Mihevec et. Al, 2023）。

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实验设计

将先前通过阳离子交换色谱（CIMmultus^TM SO3）捕获的AAV2/8血清型样品在缓冲液A中稀释，上样至CIMac^TM AAV empty/full -0.1分析柱（3.66E + 11 vg/CV）。

PATfix系统（BIA Separations）用于色谱分析。

检测器设置

  

• 电导率和pH值

• 吸光度（260nm，280nm），50 mm UV流通池

• 荧光（激发/发射：280/348 nm）

• 光散射（角度：90°）

流动相

 

缓冲液A：

• 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl₂+ 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0

缓冲液B：

• 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl₂+ 400 mM NaCl + 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0 或

• 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl₂+ 450 mM TMAC + 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0 或

• 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl₂ + 400 mM 氯化胆碱 + 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0

缓冲液C：1 M NaOH + 2 M NaCl

缓冲液D：1 M 乙酸铵

方法

用100 柱体积（CV）缓冲液B（洗脱液）进行从0%至100%的梯度洗脱。按照指导手册的方法进行柱平衡和原位清洗（CIP）（使用缓冲液A进行2分钟柱平衡，再用缓冲液C用于原位清洗1分钟，之后使用缓冲液D清洗去除NaOH。最后使用缓冲液A使电导率和pH值恢复到缓冲液基线水平）。

根据标准方程푅 = 2 푡_F − 푡_E / 푤_F + 푤_E，基于荧光计算峰间分离度:，其中 t_F和 t_E是保留时间，w_F 和 w_E 是AAV实衣壳和空衣壳基线处的峰宽。根据荧光信号也计算了AAV空衣壳和实衣壳的百分比（% E和% F），一些色谱图中也对UV和光散射进行了比较。

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结果

筛选不同的洗脱盐：

在不添加2 mM MgCl₂情况下，使用三种不同配方的缓冲液B：每个色谱图显示2至3个重叠峰。空衣壳在第一个和第三个峰中洗脱分离（使用TMAC和氯化胆碱的缓冲液，第三个峰未分离），实衣壳在第二个峰中洗脱。使用季铵盐观察到更高的AAV空/实衣壳分离度，但第三个未分离的峰看起来像实衣壳峰的延长拖尾。

在添加2 mM MgCl₂情况下，使用三种不同配方的缓冲液B：每个色谱图显示两个重叠的峰。第一个峰为空衣壳，第二个峰为实衣壳。向缓冲液中添加镁会导致分离度降低，并使所有洗脱盐的洗脱曲线更统一。然而，空衣壳峰的响应增加并且峰变窄。

色谱峰积分示例，主馏分显示在相应的色谱峰中。生成以下色谱图时未添加镁：

所有测试盐（紫外、荧光和光散射信号）在有或无 MgCl2 的情况下的色谱叠加图：

使用NaCl作为洗脱盐，有MgCl₂（实线）/无MgCl₂（虚线）的色谱叠加图。

不添加Mg可见三个分离峰。

使用TMAC作为洗脱盐，有MgCl₂（实线）/无MgCl₂（虚线）的色谱叠加图。

如果不添加MgCl₂，则无法分离第三个峰。洗脱电导率更高（对使用NaCl梯度以低电导率洗脱的血清型可能有用）。

使用氯化胆碱作为洗脱盐，有MgCl₂（实线）/无MgCl₂（虚线）的色谱图叠加。

如果不添加MgCl₂，则无法分离第三个峰。与TMAC相比曲线相似，但洗脱电导率更低。

实验结果总结

基于荧光信号的AAV实衣壳的

分辨率和百分比

要点：

向缓冲液中添加镁会降低分离度，但会改善所有洗脱盐的洗脱曲线。这意味着只有两个峰被分离，左峰是空衣壳AAV，右峰是实衣壳AAV。尽管NaCl分辨率较低，但有氯化镁时，如果在两峰之间的最低信号处画垂直线到X轴用作区分空AAV衣壳和实AAV衣壳，则能显示出与无氯化镁时相似的实衣壳百分比（详见上图示例）。

与NaCl相反，季铵盐（TMAC，氯化胆碱）在无氯化镁时导致更宽的峰，更高的空/实衣壳分离度，并且第三个空衣壳峰洗脱于峰尾并没有与实衣壳峰分离。然而，添加 MgCl₂时季铵盐显示出比NaCl更好的分离度。其中一个可能的原因是它们作为去离液盐，可以稳定空病毒衣壳和实病毒衣壳之间的疏水作用。

欢迎尝试上述的方法！如果需要帮助，请与我们取得联络。