快速可靠的分析是工艺开发过程中的关键。外泌体工艺开发的过程监控也是一大挑战。各类囊泡的尺寸都超出了体积排阻色谱的分辨范围。外泌体吸收很少的紫外线，这使得它们难以从有更丰富和更强的吸收紫外线能力的宿主蛋白质和DNA（尤其是以残留染色质的形式）中进行色谱检测和区分，特别是以残余染色质的形式。

外泌体和其他囊泡类型是复合脂质膜组合体，并含有自身的核酸和多种蛋白质。它们在很宽的分子量范围内产生会多个不同强度的条带，这使得不同囊泡类型之间的电泳条带很难区分，尤其是在污染宿主细胞蛋白质的背景下。其中一些阻碍可以克服，但这需要时间。

对于外泌体特异性抗原，可以通过蛋白质印迹法（Western blotting）增强电泳，但这很费力，需要将测定时间增加到至少两天。ELISA 可以自动化以增加通量，但仍然需要将近两天的时间。斑点印迹法（Dot-blotting）缺乏Western blotting和 ELISA 的灵敏度和特异性，并且仍然需要一天中的黄金时间。此外，建立高质量的抗体库这本身就是一个项目。这些额外的要求大大增加了分析负担，也会往往阻碍对纯化选项的深入探究。

BIA本系列的三篇文章聚焦于外泌体分析纯化的挑战。本文是该系列的第二篇，介绍可实现外泌体在线色谱检测的新分析方法。一种方法可以将细胞外囊泡与非囊泡污染物区分来，一种方法有可能将外泌体与其他囊泡区分开来。示例说明了如何能够开发更有效和更有据可查的纯化方法。
 

外泌体过程监测的新分析方法：

在线 SEC-MALS/UV

多角度光散射 (MALS) 代表了一种色谱分析过程中用于检测样品大小的新选择。激光束穿过样品时，检测器从多个角度读取散射信号。信号强度随样品大小而增加。该技术通常与体积排阻色谱（ SEC） 结合使用。图 1 叠加了应用于 SEC 柱的含有细胞培养产物的外泌体 MALS 和 UV 图。在样品成分太大而无法进入颗粒孔进行洗脱的空隙峰中，MALS能够显著提高灵敏度。

然而需要强调的是，该峰不仅仅由外泌体组成：它包含所有细胞外囊泡和高分子量聚集体，还可能进一步包括病毒、脂质-脂蛋白结合和细胞碎片。然而，MALS 使得一些只能通过UV吸光度法微弱地检测到的产物群体变得可见。MALS 还可用于获取有关峰内产物大小分布的信息。为了提供有关任何单一产物大小的有效信息，它必须以纯化合物的形式被洗脱。

混合物产生的结果表示组分的平均大小，根据每个组分在整个样本中所占的比例进行重量平均，但 MALS 仍然可以提供有用的信息。图2将部分纯化外泌体制备物的SEC实验中的旋转半径图与散射强度进行了对比。请注意，表观尺寸通过空隙峰的前侧迅速下降，表明较大的产物在该区域富集。峰的其余部分似乎由与外泌体大小范围相同的产物组成。应该理解的是该图中较大颗粒的尺寸大小因为它们与较小颗粒混合而被低估了，而较小颗粒的尺寸由于它们与较大颗粒的混合而被高估了，但是对于说明它们相对的分布情况仍然非常有用。纯物质的尺寸分布往往产生水平的半径图。

SEC-MALS/FLD 联合免疫荧光

通过将 SEC 与免疫荧光 (IF) 结合可以获得更多的信息。这是通过使用荧光抗体偶联物对样品进行预染色来检测特定的囊泡标记，然后用荧光检测器读取荧光信号来进行的。可以同时监测 MALS 和 UV 以提供更全面的表征。图 3 代表了一次应用，其中部分纯化的样品用 CD9-FITC 染色。CD9 染色标示所有细胞外囊泡类型。MALS 检测所有囊泡类型。正如预期的那样，荧光信号与 MALS 非常吻合。约 23 分钟处的另一个荧光峰对应于未结合的抗体偶联物，而约 28 分钟处的第三个荧光峰对应于游离荧光团。
图 4 展示了一系列 SEC 色谱图，这些色谱图来自用 CD63-FITC 染色的部分纯化样品的阴离子交换馏分（AEX 色谱图未显示）。在这种情况下，荧光峰明显向 MALS 峰的尾端洗脱。回想一下，图 2 表明该区域由代表外泌体的较小囊泡组成。还要注意 MALS 与峰间荧光比率的差异，第一个组分显示最高的 CD63 与 MALS 比率以及最高的 CD63 与 UV 比率。除了强调这种方法在一系列层析组分中能区分不同囊泡群的效用外，这些结果还表明了阴离子交换层析分离这些囊泡群的能力。

区分囊泡类型的免疫标记物

不同的免疫标记物可用于识别不同的囊泡类别，但目前还没有任何一种标记物可以支持明确的区分。因此，建议通过全凝胶蛋白质印迹上至少三种不同的免疫学标记来确认外泌体的存在（图 5）。全凝胶是必要的，以证明印迹条带对应的抗原是正确的分子量，并证明二抗不存在非特异性交叉反应。SEC-IF 是对蛋白质印迹法的补充，但它不能取代蛋白印迹法，因为抗原仍然与完整的外泌体结合，因此无法确认其单个分子量。然而，使用 SEC-IF 可以防止二抗非特异性染色的潜在问题，而且它比蛋白质印迹法快得多。三种不同的荧光抗体系列染色可以在不到两小时完成，而不用花两天的时间进行蛋白质印迹分析，并且自动进样器能够以最少的劳动力实现高通量。

阴离子交换层析联合MALS

MALS 还可与离子交换等梯度色谱法结合使用。图 6 比较了细胞培养产物和部分纯化外泌体的洗脱曲线。请注意，与部分纯化样品中更窄的分布相比，粗样品中呈现囊泡的广泛分布。这证实了图 4 关于阴离子交换色谱实现囊泡分馏的能力。这并不意味着阴离子交换色谱必须根据囊泡大小或类型进行分馏，但它确实突出了在线 MALS 的实用性，它可以提供囊泡洗脱位置的定量指示而无需进一步分析。这可以大大加快工艺开发。

实用分析工具

有可用的分析工具能够允许及时检测和表征目标产品和主要污染物，是任何产品纯化的重要先决条件。这对外泌体来说是一个挑战，因为它们本身并不能通过电泳或通过紫外吸光度监测的色谱法产生清晰、区分良好的特征。

蛋白免疫印迹分析可以部分填补空白，但其速度慢、劳动密集和非定量的局限性严重加重了纯化工艺开发和生产制造流程的负担。

将 MALS 与梯度色谱方法相结合，可以在色谱图上直接显示囊泡，并进行定量检测，无需额外的时间和劳动力。进一步整合荧光增加了免疫学确认以及 MALS 的大小区分。即使使用 MALS/IF-SEC 对分数进行二次评估，也可以比从蛋白印迹分析更快的获得结果，并且它们是定量的。

这些新的分析工具，使得探索外泌体纯化技术变得可行，这些技术比用于实现外泌体富集和宿主细胞污染物减少的基本方法有更高的能力。

在未来的推送中，

我们将继续介绍：

●使用整体柱的可扩展外泌体纯化方案；用于管理DNA 和非外泌体囊泡杂质的可扩展纯化工具和技术。

敬请期待！

本文来源：BIA Separations

一直以来，BIA Separations是质粒DNA、AAV、mRNA高效率纯化的引领者。不仅提供整体柱及平台方法，还提供定制的纯化服务，以满足质粒DNA、AAV、mRNA规模化生产的纯化需求。

 

阴离子交换色谱的效用也表明阳离子交换色谱应该也是有用的。蛋白印迹分析表明一些外泌体结合而另一些则不结合（未显示）。阴离子交换和阳离子交换结果均可通过系统修改柱平衡和洗脱条件进行调整。疏水相互作用层析和其他梯度方法扩展了选择范围。将这些方法中的任何一种与 MALS 相结合，可以大大简化为实现特定分离而进行的发掘和优化任务。

遗憾的是，IF 不能与梯度色谱法联合使用。抗体和与其偶联的荧光团具有强电荷和疏水性特征。结合到囊泡表面后免疫偶联物可以影响囊泡保留。在大多数情况下，这会导致标记的囊泡在与抗体偶联物相同的位置洗脱。只有尺寸排阻色谱（SEC）支持IF检测，但这种情况下也不理想。

从逻辑上讲，结合到囊泡外部会产生更大尺寸的复合物。因为囊泡主要在大小区分为零的空隙体积中洗脱，所以效果是可以容忍的，至少对于使用小合成荧光团的免疫偶联物而言是这样。使用大蛋白荧光团如藻红蛋白 (240 kDa) 的偶联物可能会掩盖对于小荧光团偶联物来说会很明显区分的囊泡大小的差异。