亲水相互作用液相色谱技术指南

HILIC（Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography）即亲水作用液相色谱。也被称为“反反相”色谱，因为在 HILIC 中固定相是极性的，流动相中的水相部分表现为强溶剂，这与传统的反相色谱法完全相反。HILIC 目前是保留和分离极性化合物最成功的方法，在过去十年中，收到制药行业中极性药物开发以及代谢组学领域的推动，HILIC 已变得日益流行。
 
HILIC 固定相

右图是目前 HILIC 色谱柱开发中常用的几种固定相类型：


 

1. 未改性裸硅胶和杂化硅胶，最常用的 HILIC 固定相，与用于正相色谱法中（流动相为正己烷和异丙醇混合溶剂）的更为常规的硅胶截然不同的是，其可被装填并储存在水/有机相中。
2. 两性离子，典型例子就是磺基甜菜碱固定相，它既有阳离子（季铵盐）基团，又有阴离子（磺酸）基团，且二者比例为 1:1，因此表面净电荷为零。
3. 酰胺键合硅胶，通过丙基或专有连接基团官能团链接到硅胶表面，在典型的HILIC流动相pH值范围内不会离子化，因此其保留特性受离子交换作用的影响小较小。此外酰胺固定相不太容易产生不可逆吸附（而氨丙基固定相经常遇到这样的问题），同时酰胺类色谱柱也表现出良好的重现性和稳定性。
4. 二醇基，表现出相当好的亲水性。
5. 氨丙基，被用于 HILIC 分离，特别是碳水化合物的分析，然而由于氨基官能团的反应特性，它们对待分析化合物（至少对还原糖）会表现出不可逆吸附。
6. 氰基，该材料在 HILIC 色谱分离中应用有限，通常表现为大多数极性化合物的保留不足，产生这种情况的原因是氰基基团没有提供氢键的能力，因此亲水性不好。

 
HILIC 应用领域



有研究表明，目前大部分 HILIC 被用于医药和临床药物市场。HILIC 日益成功的另一个因素是它适用于分析多种生物类化合物，这些化合物由于本身的药效学特性而开始被当时的制药行业所关注。一些生物技术应用，特别是与蛋白质组学、代谢组学和糖组学研究都有 HILIC 应用。
 
HILIC 保留机理

HILIC可以被认为是反相高效液相色谱（RPLC）通过采用极性固定相来运行的一个变化。实际上，HILIC 中采用的流动相是含有少量水/缓冲液或其它极性溶剂的高度有机相（>60%，典型的是乙腈）。流动相中的水形成一个富水层被吸附在固定相的极性表面。极性分析物优先进入这种富水层，有研究表明它们通过以下几部分构成的一个复杂的混合模式被保留下来：

• 分析物在富水层和大量流动相之间的亲水分配作用
• 极性官能团和固定相之间的氢键相互作用
• 离子官能团上的静电相互作用

此外，在合适的实验条件下，也可能存在固定相（或硅氧烷基团 在非常低的有机溶剂浓度下）上的键合配体的疏水性部分和分析物的非极性部分之间的范德华相互作用。

HILIC 优势

1. 在反相色谱（RPLC）中，如果不用离子对试剂的话，亲水性化合物时很难保留的。与疏水性相反，HILIC 洗脱顺序主要基于分析物的亲水性，所以 HILIC 的选择性与 RPLC 的选择性是互补的。
2. 流动相中具有较高的有机相含量，HILIC 在与电喷雾电离质谱（ESI MS）检测共同使用时，高有机流动相能确保高效去溶剂化，提高信号/噪音比（S/N）。
3. 由于高有机流动相的粘度低，其具有低背压。当使用亚 -2 μm 的颗粒时，这就特别有意义：低背压允许快速分析时采用高流速。
4. 在采用 100% 非质子有机溶剂时，与固相萃取提取物能很好地兼容。这样样品就可以直接进样而不需要浓缩近干和用流动相重新溶解。

 
HILIC 局限性

1. 样品溶剂与流动相不匹配而导致色谱峰变形，当采用水性样品溶剂时，这会损害待分析物进入固定相中的分配，对分析物的色谱峰形状不利，还容易造成色谱柱过载，降低保留和分离度。
2. 在动力学上，HILIC 的作用机理比 RPLC 中的作用机理要慢很多，从而导致需要较长的色谱柱平衡时间（通常比在 RPLC 模式中多两到四倍）。
3. 当采用高比例的有机溶剂时，无法准确测量流动相的 pH 值。

 
Thermo HILIC柱

Thermo Fisher 公司提供的HILIC模式的液相色谱柱有以下几类，对应固定相类型见下表。



具有较高亲水性程度的固定相材料如下图右手边所示。例如 Thermo Scientific Accucore 150-Amide-HILIC 酰胺色谱柱，是这些固定相中极性最大的，应该选择用来分析强极性的分析物（而在较小极性的固定相上可能不会获得足够的保留）。
虽然在 HILIC 模式中最主要的保留机理是分配吸附，但刺激静电相互作用在分离中也可以发挥重要的作用。
对于带电分析物，利用固定相的离子交换特性对其有利，具有阳离子交换性能的材料显示在 X 轴上面，而具有阴离子交换性能的材料（一种阴离子交换剂）显示在 X 轴下面。以 Thermo Scientific Syncronis Silica 为例，其具备相当大的阳离子交换特性材料，推荐用于碱性化合物的分析，不过此材料将不适用于保留酸性化合物。
另一方面，Thermo Scientific Hypersil GOLD HILIC 具有阴离子交换性能，可考虑用于酸分析，但会降低碱性化合物的保留。
Thermo Scientific Acclaim HILIC-10、Accucore Urea-HILIC、Syncronis HILIC和Accucore 150-Amide-HILIC 不具备离子交换性能的材料，适用于带电的和中性分析物分析。