使用整体式离心柱用于CGE分析的大肠杆菌细胞裂解液快速脱盐

中和的大肠杆菌细胞裂解液是质粒DNA（pDNA）生产过程中的复杂中间样本，该质粒DNA作为现代疫苗、基因及细胞治疗的核心载体。裂解液成分分析对过程表征至关重要，可实现pDNA上游和下游加工的优化规划。pDNA异构体组成常采用毛细管凝胶电泳结合激光诱导荧光检测（CGE-LIF）进行分析，该方法具有高灵敏度和高分辨率特性。

E. coli细胞裂解液基质的复杂性，加之其典型低浓度的质粒DNA，为建立快速可靠的分析方法带来了挑战。低样品基质电导率对CGE中的稳定注射至关重要（图1）；因此，样品制备（如脱盐处理）是裂解液分析前的关键步骤。裂解液样品制备的主要风险与挑战包括：

"保持与原始样品相同的核酸谱系

样品制备方法的速度与稳健性

高分析物回收率

避免稀释本已浓度较低的样品

我们开发了一种创新的快速脱盐方法，利用对流交互介质（ClM'）整体式离心柱（ClMspin Swiper）处理核酸溶液，并测试了其中性化大肠杆菌裂解液的脱盐效果。ClMspin Swiper柱采用结合-洗脱机制，仅结合各类核酸而有效去除杂质盐分。洗脱可直接使用CGE样品缓冲液完成（图2）。本文提出的新型样品脱盐方案，并与基于超滤的脱盐技术进行了对比——后者通常采用不同截留孔径的离心滤膜进行处理。

首先，我们按照图3所示流程，使用ClMspin柱或离心滤器对相同的中和E. coli脂质体进行脱盐处理。随后，采用电泳动力注射法进行定量pDNA异构体组成分析，通过CGE-LlF技术对对照组与处理组样本进行分析。分析在PA800 Plus系统（SClEX）[1]上完成。处理后的样本还通过PATfix HPLC系统搭载ClMac pDNA-0.3分析柱（6微米）进行检测，该系统不仅提供质粒DNA异构体组成的定量结果，还可测定质粒DNA浓度[2,31]。

l  经ClMspin Swiper色谱柱处理的裂解液在核酸检测中展现出最高CGE信号灵敏度（图4和表2）。

l  Amicon® Ultra（30kDa）色谱柱处理后，裂解液的核酸谱系发生流失，而ClMspin Swiper色谱柱处理则保留了裂解液的核酸谱系特征（图4、图5及表1）。Ultra（30kDa）则因孔隙作用导致部分细菌RNA渗入滤液（图4、5及表1）。

l  CGE分析在pDNA异构体分辨率上更优（SC pDNA多聚体与单体分离清晰）。然而基于HPLC的方法更具稳定性（图4、5）。

l  未经脱盐处理的中和裂解液仅能通过HPLC ClMac pDNA色谱柱分析（图5），因其盐含量过高，无法在CGE上实现高效电泳注射（图4）。

l  裂解液中测定的RNA:pDNA比值在CGE分析中低于HPLC处理样本（表1），这可能是因为插入型荧光染料（CGE分析所用）的染色灵敏度高度依赖于核酸链的数量。针对双链物种优化的试剂对单链物种的灵敏度较低。